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转盘超分辨活细胞成像技术SpinSR

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2017/11/7     浏览次数:    

通过以往的介绍,我们初步了解了共聚焦激光扫描显微成像技术(Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM)和双转盘式共聚焦成像技术(Spinning Disk Confocal)。与点扫描共聚焦较大的区别是,转盘共聚焦同时扫描多个激光焦点,然后通过面阵检测器(area detector)比如CCD/sCMOS/EMCCD相机来高速采集图像信号。这样,整体成像速度得到了极大提高,同时也能减少对样品的光漂白光毒性。因此转盘共聚焦特别适合用于活细胞共聚焦成像。


光学超分辨

由于光学衍射的限制,荧光显微镜在细胞生物学里能观察到的亚细胞结构局限于200nm左右,需要有更高的光学分辨率来解析这些结构。过去的十几年,光学超分辨技术发展得如火如荼,

photoactivatable localization microscopy (PALM; Betzig 2006), stochastic optical reconstruction microscopy (STORM; Zhuang 2006), 以及 stimulated emission depletion microscopy (STED; Hell 1994) 可以将光学分辨率提高至50nm,但是PALM/STORM/STED技术在成像速度上满足不了活细胞的成像需求,同时由于原理上的限制,现阶段有些现有生物荧光样品还不能使用这些超分辨技术。还有一种成像技术structured illumination microscopy (SIM; Heintzmann and Cremer, 1999) 可以将分辨率提到到120nm左右,并且对于生物荧光样品的限制不多,普通荧光显微镜或者共聚焦显微镜能用的样品在SIM系统上也能使用。但是,SIM技术在成像速度上的改进不是很多,提高到11/秒,因为需要915帧左右的原始图像来重建一幅SIM图像。在此基础上,3D-SIM可以将轴向分辨率提高到100-200nm。但是大部分情况下,SIM成像深度局限在10 - 20um,而且SIM图像重建时容易产生条纹状瑕疵。


技术名称

XY轴分辨率

Z轴分辨率

速度

染料

检测器

Confocal

200

500

ms·s

所有

PMT/APD

TIRF

200

100

ms

所有

CCD/sCOMOS

SIM

130

250

ms

大部分

CCD/sCOMOS

STED

85

560

ms·min

有局限

PMT/APD

PALM/STORM

25

100

min

有局限

CCD/sCOMOS


针对活细胞/活组织显微成像,转盘共聚焦有非常大的优势,极低的光毒性和光漂白对于长时程荧光成像有很大的帮助。如果有一种技术,既能够保留转盘共聚焦的优势,又能够在特定的实验需求时提供更高的光学分辨率,那对于生命科学领域内的很多显微成像实验将带来革命性的变化。


转盘共聚焦 + 光学超分辨

Spinning-disk based Super-Resolution采用Yokogawa CSU-W1扫描头,可以在宽场荧光Widefield、转盘共聚焦Confocal、以及转盘超分辨SpinSR三个模式之间自由切换。这种情况下,可以根据实验的具体需求来选择更适合的成像模式,也有些时候需要拍摄两种模式下的荧光图像以此来确认具体哪种技术更适合样品。


 

 

那么,基于转盘共聚焦的超分辨是如何实现的呢?从广义上讲,转盘在高速扫描的时候,使激光在样品上也形成了类似SIM的结构光照明。和传统SIM技术不同的是,转盘SR技术在科研显微相机检测之前将荧光信号通过一样的条纹结构,从而实现信号的解调制;传统SIM技术在相机前没有解调制,需要三张甚至更多的原始图像来重建SIM超分辨图像。

通过转盘SR这种超分辨成像方式,可以实现更高帧速,且避免传统SIM技术在图像重建时候容易出现的条纹瑕疵。

转盘SR在显微成像速度上的表现:可以观察到线粒体外膜的超分辨动态变化,下图中红色箭头所示,每帧图像间隔100ms


转盘SR的成像深度

硅油物镜(silicone oil)已经在各种显微成像系统里验证了其对成像深度的帮助,由于硅油的折射率相比较水更接近生物细胞或组织的折射率,可以极大提高图像质量以及成像深度。下右图是60倍硅油物镜在大脑新皮层(Neocortex)的共聚焦成像深度和图像质量。

 

转盘共聚焦扫描头CSU-W1配合硅油物镜,也验证了在生物组织中可以实现较高的成像深度。下图是小鼠早期胚胎(100um)三维成像。

Early stage mouse embryo. 

Data:  Kazuo Yamagata, Ph.D., Center for Genetic Analysis of Biological Responses, The Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University


Olympus转盘超分辨活细胞成像系统SpinSR

系统概览:

1) 全电动倒置荧光显微镜IX83,带第四代活细胞防漂移模块ZDC

2) 大视野转盘共聚焦模块Yokogawa CSU-W1

3) 转盘超分辨光学模块SpinSR

4) 高速高灵敏度sCMOS科研相机Hamamatsu Flash 4.0 V3

5) 专业显微成像软件cellSens

产品链接:

https://www.olympus-lifescience.com.cn/landing/ixplore/ixplore-spinsr/

引自 江文显微课堂



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